常见问题

1.请阅读剩下的常见问题解答。

2.在713-834-6096致电Hawke博士，设定预约，详细讨论您的项目，包括行政和实验问题。

是的。首先，应对此实验进行新鲜的运行缓冲区。大多数实验室都使用商业预铸造凝胶，并且通常它们是可以的，只要他们没有通过他们的到期日期即可。有关更多提示，请阅读以下项目或联系我们的实验室。

一个好的经验法则是用考马苏斯染色或银染色得到可见的条带，或至少10-100 fmol的蛋白质。在某些情况下，我们通常使用的蛋白酶(胰蛋白酶)并不适合你的蛋白质;这种情况更可能发生在小蛋白质上。在这种情况下，需要更多的蛋白质或者一种不同的酶。

如果您无法使用典型的凝胶污染才能看到它，那么可能没有足够的蛋白质来识别，并确保您切割正确的频段。此外，WB只会看到您的蛋白质，因此可能存在许多干扰蛋白质的可能性;你根本看不到他们的wb。此外，如果你在凝胶上跑过整个细胞裂解物，呈暗示它，那么跑来一只西方，即使你使用非蛋白质阻塞剂，我们也能找到任何有趣的东西。唯一的现实机会是做一个IP。

角蛋白通常来自人类污染，并可以在处理过程中几乎任何点引入。建筑物内的灰尘通常是人的皮肤薄片，所以小心避免灰尘会有所帮助。保持样品覆盖，仔细清洁所有接触样品的玻璃器皿和塑料器皿，戴无粉手套，不要徒手接触样品(或样品溶液)，避免使用社区试剂，使用专用设备，这些都有助于减少角蛋白污染。

我们非常密切地监测正在进行的样本分析中的角蛋白水平，如果我们怀疑有问题，就立即中断样本队列。我们使用的试剂是大批量制备的，同价，冷冻，并仔细测试性能和污染。我们的大多数操作都在标准的2级通风柜中进行，以减少污染。我们通常仍然可以在我们自己准备和加工的样品中检测到低水平的角蛋白，但是很难将角蛋白降到零。

您的实验室可能会使用非脂肪牛奶的许多蛋白质印迹，因此大部分玻璃和塑料用品可能被牛奶蛋白污染。虽然这可能对您的WBS有所帮助，但它使得难以做的质谱，因为质谱仪将“见”来自所有这些蛋白质的肽。玻璃器皿充满了玻璃器皿，在蛋白质饱和后足够清洁，简单的解决方案是为了获得几个钥匙的设备，仅为此目的储备它们，并且不会将它们暴露于牛奶蛋白。

有几个可能的策略来减少IP洗脱中的抗体量。一种是尽可能使用竞争洗脱，例如使用抗原肽(FLAG, Myc等)。另一种是使用共价结合抗体。如果你使用的是带有his标签的结构，最后一步可能是金属柱，而不是抗体。

您可以执行试用ip并通过WB监控它们。一个目标是尽可能多地拉下目标蛋白，这可以通过对上清液进行WB来评估。然后，从珠子中尽可能多地洗脱，再次由WB确定，最后一个珠子可以使用热SDS-PAGE装载缓冲液进行多次洗脱。最后按比例放大，试试银色或胶体考马斯亮染色凝胶。希望您也有一个具有代表性的对照，用于检测特定的粘合剂(假设您正在研究一个复合物)。这种凝胶可以让你了解目标蛋白的数量，以及“其他”想要的或不想要的蛋白质。

这取决于你所需要的蛋白质有多丰富。一般来说，你需要使用更多的裂解物为质谱比你习惯的western blotting。一个合理的起点可能至少是西方蛋白质用量的10倍，但可能需要进一步放大才能看到有趣的蛋白质。

不。在IP实验中，我们几乎总是能够在从凝胶中剪下的每条带中识别出几种蛋白质。

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不。实际上，这意味着蛋白质可能会出现，在列表中“较高”的蛋白质更有可能出现，而较低的蛋白质不太可能出现，这主要取决于总分数和匹配肽的分数。得分在200分以上的蛋白质几乎可以肯定是“真实的”，但随着得分下降，假阳性的可能性会增加。我们通常会对你感兴趣的较弱的冲击进行评估，试图对假阳性的风险进行分层。弱匹配可能是弱的，因为蛋白质含量很少，或者可能是假阳性。如有要求，我们将给出这类比赛的最佳估计。然而，是否进行弱匹配的决定取决于调查人员。