小鼠ES细胞的经典基因靶向研究
胚胎干细胞的基因靶向技术是在特定的染色体位点上引入突变的一项有力技术。该技术是基于实验证明外源DNA可以在培养的细胞中通过同源重组精确地整合到基因组中。随着ES细胞技术的出现，通过同源重组来改变靶基因，同时保持细胞的多能性状态的方法已经开发出来。引入胚胎干细胞的基因改变可以通过将基因改变的胚胎干细胞注射到小鼠早期胚胎中形成嵌合体而传递到小鼠生殖系。同时，基因靶向和ES细胞技术使研究在活的有机体内通过内源基因的修饰来基因的功能。
GEMF服务
由研究者提供的线性化靶向载体将通过电穿孔导入ES细胞。这些细胞将在适当的选择培养基上生长。从存活下来的克隆细胞中提取的DNA将提供给研究人员进行Southern或PCR分析。阳性克隆将被扩增和冷冻，并将保留在GEMF内，以便后续进行囊胚注射或给予研究人员(应要求)。
成本
MD安德森调查人员每建筑5000美元;MD·安德森下属的调查人员每构建8200美元;其他外部调查人员每建筑$13 284
基因靶向ES细胞的时间线
- 第1天：开始用于电穿孔的ES细胞培养物
- 第5天：电容靶向载体
- 第六天:开始药物选择
- 第16天：挑选所有存活的克隆，或多到3 x 96孔板（总计288个）或双重抗性菌落（可以挑选额外的板。接触电流管理经理。）
- 第20天:将ES细胞在4 × 96孔板上分离培养(对于每一个选择的96孔板)，2个重复在-80°C下暂时冷冻，其余2个生成DNA供研究者进行重复Southern分析
- 第23天：从96孔板中提取DNA，并向研究者提供筛选。
细胞扩展的时间线
- 第1天:根据PCR或Southern杂交结果扩增3个目标克隆(可以扩增其他克隆)。联系设施经理了解当前的价格。)
- 第6天：提供给调查员的大规模DNA进行重新确认
- 第21天：液氮中的冷冻细胞
要点需要考虑
基因靶向实验非常耗时和劳动密集型。以下是设计基因靶向实验时需要考虑的一些要点，以避免昂贵的延迟。
基因组DNA的来源
在构建靶向载体时，使用与ES细胞系具有中间原因的基因组DNA非常重要以确保同源重组。我们目前有129SVEV（S6），129 / SV / J（X1）C57BL / 6N和Hybrid 129SVEV / C57BL / 6 ES细胞系，我们在我们的设施中常规使用。如果对设施进行了现有的布置以确保同一背景的ES细胞系的可用性，则可以使用其他遗传背景。
识别靶向ES细胞克隆的策略
确定用于确定靶向克隆的方案是基因靶向实验中最重要的部分。必须严格地测试该战略，并证明是可靠和可重复的。由于实验的这一方面是如此至关重要的并且经常被证明是有问题的，因此GEMF要求每个调查员提交证明其策略的可行性的数据，以及在启动之前证明检测同源重组的适当控制的PCR或Southern分析。任何ES细胞工作。
从GEMF获取服务
- 预约Jan Parker-Thornburg(电话:713-745-2654或发电子邮件)jpthorn@mdanderson.org）审查目标战略。我们将涵盖实验设计，从靶向向量的施工到靶向事件的诊断分析方法
- 用机构生物安全委员会（IBC）批准编号提供DNA重组研究的GEMF乐动体育LDsports中国
- 登录到https://mdanderson.ilabsolutions.com，注册帐户，然后转到网站以请求服务
- 提供根据指定协议编制的目标载体的设施。目标载体的详细地图和用于识别目标克隆的策略以及试验实验的结果进行分析，同时提交
- 当电穿孔和选择完成时，该设施将提供具有来自选定的ES细胞克隆的未切割基因组DNA的重复的96孔板的研究者。研究人员应对这些DNA进行PCR或基因组南方分析，并将所得薄膜带到设施中进行审查。将扩大三个阳性克隆，并通过基因组南部分析提供来自每个所选克隆的来自每个所选克隆的等分试样进行确认
- 冷冻的靶向胚胎干细胞将保存在设施中，用于后续的囊胚注射，或可根据研究人员的要求提供
读了政策和程序关于GEMF提供的服务的重要信息部分。
笔记：基因靶向是一种实验，其既昂贵又耗时。因此，目标是通过和有条不紊地策划的目标策略必不可少。通过在基因定位策略的周到设计中投入时间，您可以节省时间，金钱和研究动物的生命。乐动体育LDsports中国