协议

用于囊胚注射的胚胎干细胞的制备

注射前五天

将一小瓶胚胎干细胞放入37°C水浴中解冻

将小瓶的含量转移到具有10mL ES细胞介质的锥形管中以稀释冷冻介质，并分散细胞

将细胞缓慢离心(< 1500转/分)5分钟

取出上清，轻敲试管以分散细胞

加入4ml ES细胞培养基并转移到一个新鲜的6cm给料板上

组织培养培养箱中的培养物（37°C，5％CO₂)，每天更换媒体

通过将500,000个细胞镀到新鲜的6cm馈线板上通过细胞通过细胞

改变媒体的日常

胚胎干细胞最好在传代后两天注射

注射日

在注射的早晨再喂培养物

在注射之前再次彻底再次培养培养物

准备10ml胚泡注射培养基*(见下文)
存储在冰上。

通过产生单细胞的悬浮来制备用于注射的ES细胞：

1. 从6cm板上去除ES细胞培养基
2. 加入1.0 ml胰蛋白酶。
3. 在组织培养箱中培养10分钟。
4. 加入2ml胚泡注射培养基。用P1000吸管完全分散细胞。检查范围内的细胞是否分散良好(我们需要注射用单个细胞)。
   
5. 将细胞悬液放入15ml Falcon试管中。
6. 通过缓慢离心（小于或等于1000rpm）的颗粒细胞3分钟。去除上过度，然后轻轻敲击管以分散细胞。
7. 加入胚泡注射培养基2ml
8. 将这个胚胎干细胞悬浮液和额外的胚泡注射介质放在冰上，并运送到GEMF。

*囊胚注入媒体

• 10毫升DMEM + 10％胎牛血清，2毫米谷氨酰胺
• 200µl(微升)1M HEPES

用于电穿孔的DNA的制备

1. 制备至少30µg的靶向载体质粒。我们推荐Qiagen EndoFree Plasmid Maxi试剂盒。或者，可以使用标准的质粒协议，然后CsCl带
2. 通过用独特的酶消化来线性化靶向载体
3. 消化后，在微凝胶上运行一小部分，检查是否完全线性化
4. 用两体积的乙醇和0.3体积的7.5 M乙酸铵沉淀DNA
5. 用清洁70％乙醇洗涤颗粒2x
6. 以1.0mg / ml的浓度重悬了0.1x TE *的DNA。电穿孔需要总共25微克线性化DNA。

笔记：

• 将DNA与醋酸铵沉淀而不是常用的乙酸钠非常重要
• 同样重要的是，根据上述方案，在0.1X TE中重新悬浮DNA颗粒，而不是水或PBS
• 不遵守以上任何一条都会极大地影响改造效率

原核注射用DNA的制备

1. 制备30-50μg的DNA。我们建议您使用质粒制备方案，从而导致内毒素，清洁质粒DNA。endofree Qiagen套件适合于此目的。
2. 消化足够的转基因结构，释放20µg片段供注射。(要注入的片段必须不包含所有向量序列。)
3. 消化后，将稀释的DNA部分放在凝胶上，检查是否完全消化。与未切割的质粒和消化过量的质粒相比(检查额外的不需要的产物)。给这个凝胶拍一张清晰的照片

将整个消化反应与凝胶图像一起注射的设施，清楚地表明要注射的片段。该设施将进一步纯化注射片段。

有关大型DNA（YAC，BAC等）的特殊准备程序，请联系设施总监

尾DNA提取

1. 将尾样品放入1.5-ml管中，管中有0.75 ml尾缓冲液*。
2. 用摇动孵育55℃过夜。
3. 以1:1的苯酚:氯仿等体积提取消化液，再取等体积的氯仿。
4. 用等同体积的异丙醇沉淀DNA。
5. 旋转沉淀物10分钟。
6. 转换管丢弃上清液。
7. 将管子放在室温下放置在纸巾上的干燥颗粒一小时。
8. 再悬浮DNA颗粒，加入80µl TE。