最佳

服务

DNA甲基化分析服务

概述

DNA甲基化分析设施由癌症表观遗传学中心和表观遗传学和分子癌变学系资助。它为所有MD安德森分校和德克萨斯医学中心的研究人员提供DNA甲基化分析相关服务。乐动体育LDsports中国服务包括:与调查人员协商，选择最佳的分析方法;最常用的基因特异性和全基因组的样品制备、分析设计和样品处理( PyroMeth，RRB和甲基-SEQ）DNA甲基化分析;开发和维持常用的测定库，以测量全局DNA甲基化（线，ALU）和常见的基因特异性试验（P16， e-cadherin.， MLH1, p15等)。该中心位于休斯顿MD安德森癌症中心的米切尔基础科学研究大楼。乐动体育LDsports中国我们拥有完备的分子生物学研究设备，并拥有Qiagen焦磷酸测序机。乐动体育LDsports中国

DNA甲基化分析的主要障碍是简单地通过测序来检测甲基化胞嘧啶。在PCR扩增期间，DNA聚合酶并类似于未甲基化胞嘧啶，甲基化胞嘧啶不会与鸟嘌呤二核苷酸配对。因此，捕获甲基化的胞嘧啶取决于间接方法。最常用的是（1）基于限制酶的方法，其利用甲基化敏感酶;（2）基于亲和力的方法，其中用于5-甲基胞嘧啶或甲基结合结构域蛋白的抗体用于收集基因组的甲基化部分，并通过水解将非甲基化胞嘧啶转化为苯硫酸盐脱氨酸反应，利用甲基化胞嘧啶与游离羟基的非反应性。这些方法中的每一种都具有重要应用，研究表观蛋白组，并且单独或组合地应用于个体基因和大规模分析。在这些方法中，亚硫酸氢盐转化是由于其在与测序方法结合时的高分辨率而导致的金标准。以这种方式，每种胞嘧啶可以鉴定为甲基化或未甲基化。

DNA甲基化分析工作流程

我们的工作流程始于研究人员提出的咨询和服务请求。乐动体育LDsports中国根据项目是调查特定基因的甲基化状态还是整个基因组，应用两种工作流程中的一种。

根据需要设计和优化候选基因测定。在进行亚硫酸氢盐处理之前评估DNA样品完整性和质量。然后进行治疗，并扩增特定的感兴趣区域和焦肌。

在全基因组研究中，还原亚硫酸氢盐测序(RRBS)应用于有关启动子和CpG岛的问题，而全基因组亚硫酸氢盐测序(WGBS)用于回答更多的全球问题。一旦样品质量得到保证，它要么被酶消化，要么被声音剪成适当大小的碎片。然后在用亚硫酸氢盐处理之前连接到DNA末端。经过处理后，测序库将被准备好并进行质量检查，然后送往下一代测序设备。

咨询和生物信息学

选择合适的DNA甲基化分析方法，取决于调查是否仍处于发现阶段，或是否已经确定了一套目标。此外，当处理最小数量的DNA或将DNA甲基化作为分子标记时，必须考虑分析设计和检测方法方面的特殊考虑。DNA甲基化分析设施将与研究人员一起设计分析方法并进行实验。如需咨询，请联系Marcos Estécio, phd, mestecio@mdanderson.org。

乐动体育LDsports中国涉及下一代测序服务的项目的研究人员应在规划详细项目之前始终咨询生物信息管理员。有关生物信息学分析的帮助，MD Anderson用户可以咨询其机构分配的部门生物信息管理员，寻求关于潜在的生物信息学合作者的建议，或联系Arif Harmanci博士。，UT健康电子邮件。

焦磷酸测序DNA甲基化分析

在二硫酸氢盐转化之后，在PCR反应中扩增基因特异性靶标与从甲基化和未甲基化等位基因的扩增器产生扩增器的引物进行扩增。选择的CPG位点在焦磷酸中反应中量化。该方法的优点是用培养基到高通量对甲基化的敏感和定量读数。

在右边的图像中，靠近基因转录起始点的区域手1基于先前的微阵列实验选择了用于测定设计。放大区域覆盖了四个CPG位点，其以黄色突出显示。在该实施例中，结肠癌细胞系RKO在所有检查的CPG位点（平均= 97％）显示出高水平的DNA甲基化，但在正常外周血淋巴细胞（6.3％）中相同的基因未甲基化。

亚硫酸氢盐测序

类似于焦磷酸测序，在亚硫酸氢盐测序中，基因特异性的目标被PCR反应扩增，引物从甲基化和未甲基化的等位基因产生扩增子。Sanger测序单个克隆产物的测序可以揭示几十个位点的甲基化状态，并识别等位基因特异性甲基化。

降低表示亚硫酸氢盐测序（RRB）

RRBS是基于酶和亚硫酸氢盐的方法的结合，由于其能够容纳不同起始量的DNA，它是当今最流行的全基因组方法之一。DNA被限制性内切酶消化，并根据大小进行选择。后适配器连接确保浓缩CpG岛。然后DNA经过亚硫酸氢盐处理，用通用引物进行扩增。得到的RRBS文库经过质量检查，然后转移到下一代测序设备进行最终处理。一般来说，在单个实验中评估了40万到100万个CpG位点。

该图像显示了前列腺细胞系RWPE-1和DU145的RRB数据的基因组浏览器视图。每个垂直条显示一个CpG位点的甲基化密度，范围为0％至100％。示出了差异甲基化区域（DMR）与替代转录开始部位的CPG岛重叠TP73基因。