方法和服务

加工/嵌入/染色非脱钙骨标本

钙黄绿素标记的（1）骨架在10％福尔马林固定的平面为不超过六小时，在4℃并脱水至80％的乙醇将项目调查被提供给核心。根据实验模型的类型（经遗传修饰的小鼠或注射骨的骨），适当的样本将被解剖并在醇溶液高达100％的乙醇，在4℃下脱水。该骨架的其余部分将被送回调查。解剖标本将根据已建立的方案（2）进行处理。它们将在4℃下在含有100ml去稳定的甲基丙烯酸甲酯（MMA），14毫升壬基苯基 - 聚乙二醇酯（NPG）和0.33克无水过氧化苯甲酰（BPO）媒体被渗透两次24小时。样品将随后在含有100ml MMA，14毫升NPG，0.55克BPO和500毫升N，N-二甲基 - 对甲苯胺99％的介质被传送。聚合将在4℃下进行。

塑料块将在颗粒感/抛光机进行修整和切片将在配备有碳化钨一次性刀片一个机动的徕卡RM2165切片机来执行。特别要注意将定位块，以确保切片时，所有的样品具有相同的方向给出。七层微米的部分将在整个注射小鼠（矢状位）或骨头收集到两个第三椎骨都达到了转基因动物或者其控制窝。一组10个连续的部分，位于动物的同一平面上，将被选择（＃1-10）进行分析。段＃1-3和8-10（7微米厚）将与冯科萨试剂染色，并通过货车Gieson染色方法的基本参数（3）的初始分析复染。此过程的污渍矿化骨基质在黑，骨样在红色和细胞介质的粉红色。部分4-7将被削减在4微米的厚度和左未染色并储存用于进一步的分析。一旦特定的请求，并在逐案的基础上，这些未染色的部分将被用于执行细胞计数（成骨细胞，破骨细胞）和量化的动态参数（BFR）。

成骨细胞数的定量，滑动＃4将被用甲苯胺蓝根据标准方案（4）染色。破骨细胞数目的幻灯片＃5量化将经受检测抗酒石酸碱性磷酸酶染色（TRAP）（4）的酶测定法，酶特别是通过在骨髓中的破骨细胞中表达。该部分将被用褪色苏木染色。滑动＃6将被留下不染色在荧光灯下矿化方面的钙黄绿素的可视化。测量将在30-35字段每个样本一个滑块来执行。样本中的所有幻灯片将被检查其避免可能的异常。

骨分析

所有骨特定的参数将在以下通过ASBMR组织形态计量学命名委员会（5）确定的准则单位来测量和表达。对于每个实验，实验和对照样品将被同时分析。建议分析的最小每组15只动物中，以减少可能的遗传变异的影响。

在分析长骨(即股骨、胫骨)或骨骼骨(下脊柱——特别是L3或L4——骨活检或颅骨)时，我们将使用现有的骨活检系统的半自动模式来测量三个参数:

• 骨体积
  • 计算为总骨髓体积所占的骨小梁（BV / TV，％）;骨体积应大于或等于测量面积的15％。分析可能需要不止一个骨部分以获得足够的骨体积
  • 骨小梁数量
• 评价为本小梁的度量为骨体积（Tb.N，毫米内场数¹）
  • 小梁厚度
• 计算作为本小梁骨体积的度量的领域内的平均厚度（Tb.Th，微米）

这些参数将提供一个可靠的估计存在增加或减少骨量的实验标本。

细胞计数和动态组织形态测定将来自两个非相邻的分段/幻灯片获得高放大倍数图像的30-35相邻场来执行。

细胞类型和测量过程

成骨细胞沿骨表面排列成簇的立方细胞。破骨细胞是大的，抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）阳性，多核沿着骨表面的成骨细胞/破骨细胞计数和动态组织形态测定需要进行评估特异性染色，并且可以是耗时的细胞。这些服务可以根据要求通过该项目研究人员进行。

成骨细胞就可以利用甲苯胺蓝，HTX或Goldner氏改良的三色染色被最好地可视化。两者成骨细胞数量（N.Oc / BPM，毫米¹）和成骨细胞表面（Ob.S / BS，％）数据将被提供给研究者。

破骨细胞可以使用TRAP酶活污渍被最好地可视化。两个破骨细胞数（N.Oc / BPM，毫米¹）和破骨细胞表面（Oc.S / BS，％）数据将被提供给研究者。

调查员收到数据

表征骨形成两个动态参数将被提供给研究者。矿物沉积速率（MAR，毫米/天）将通过注射由标记事件之间的时间间隔划分施用两种不同的钙黄绿素标记的中点之间的距离来测量。矿化表面（MS）是通过将双标签表面和单标签表面上的一个半计算和总骨表面分开。的骨形成率（BFR / BS，毫米³/毫米²/天）通过由MS的MAR相乘来计算。

的时间间隔被定义为注射钙黄绿素如下：

• 10-14天在大型动物身上
• 2-7天的小动物;为期4天的间隔已被证明非常适合小型啮齿动物